Bakterie jako wskaźniki analizy wody

Podczas rutynowej analizy mikrobiologicznej wody nie można jednoznacznie zidentyfikować wszystkich potencjalnie patogennych bakterii. Dlatego wprowadza się pojęcie bakterii wskaźnikowych. Możemy podzielić je na dwie główne grupy: wskaźniki zanieczyszczeń organicznych oraz fekalnych.

Kilka słów o metodach i hodowli bakterii wskaźnikowych

Metody hodowli bakterii wskaźnikowych polegają na namnażaniu mikroorganizmów na odpowiedniej pożywce. Proces ten jest kluczowy dla bezpośredniego badania bakterii. Charakter wzrostu bakterii jest ważny dla ich identyfikacji. Charakter wzrostu kolonii bakteryjnych, takich jak ich kształt i kolor, jest istotny dla ich identyfikacji i klasyfikacji taksonomicznej. Hodowle są prowadzone na sterylnych pożywkach, dostarczających składniki odżywcze i wodę, co jest ważne zarówno w badaniach naukowych, jak i praktycznych zastosowaniach, np. w diagnostyce medycznej czy przemyśle spożywczym.

Hodowla jest podstawową procedurą stosowaną do bezpośredniego badania bakterii.

Pożywki do hodowli mikroorganizmów

 
Istnieją dwa rodzaje pożywek używanych do hodowli mikroorganizmów: syntetyczne i naturalne. Pożywki syntetyczne mają dokładnie określony skład chemiczny, zawierając m.in. glukozę jako źródło węgla, źródło azotu (zwykle siarczan amonu lub chlorku amonu), czyste aminokwasy, witaminy i czynniki wzrostu. Natomiast pożywki naturalne składają się z surowców pochodzących z kwaśnej hydrolizy kazeiny, żelatyny lub enzymatycznej hydrolizy mięsa (np. przy użyciu pepsyny, trypsyny, pankreatyny). Skład pożywek naturalnych jest bardziej złożony i nie można go dokładnie zdefiniować chemicznie. 

Wśród pożywek wyróżnia się również: uniwersalne i selektywne. Pożywki uniwersalne, znane także jako nieselektywne, wspierają wzrost różnych mikroorganizmów. Natomiast selektywne tworzą optymalne warunki dla określonych grup bakterii, na przykład tych zdolnych do wiązania azotu z powietrza. Szczególną kategorią są pożywki selektywne diagnostyczne, które wspierają wzrost wyłącznie określonych bakterii i zawierają wskaźniki zmieniające kolor w obecności charakterystycznych mikroorganizmów.

Wskaźniki zanieczyszczeń organicznych

Wskaźniki zanieczyszczeń organicznych są mniej istotne z punktu widzenia higieny i stanowią sztucznie utworzoną grupę. Składają się na nią wybrane bakterie, drożdże i pleśnie, które mogą rozwijać się w ściśle określonych temperaturach na podłożach nieselektywnych, bez wpływu czynników selektywnych. Przeważają w niej mikroorganizmy takie jak rodzime (autochtoniczne) mikroorganizmy wodne oraz mikroorganizmy pochodzące z gleby lub systemów korzeniowych roślin.

Ich obecność w wodzie odzwierciedla ogólny stan regeneracji mikrobiologicznej, a liczba wykrytych bakterii wskazuje na poziom zanieczyszczenia wody łatwo rozkładalną materią organiczną. Jednakże, ograniczenia w hodowli sprawiają, że możemy wykryć tylko niewielką część tych mikroorganizmów, które faktycznie występują w wodzie. Mimo że nie są one kluczowe z higienicznego punktu widzenia, mogą być przydatne w procesach uzdatniania wody.

Bakterie jako wskaźniki analizy wody: analiza mikrobiologiczna wody

Analiza mikrobiologiczna skupia się na bakteriach, których optymalna temperatury wzrostu to od 20 do 37˚C oraz rozwijają się na podłożach nieselektywnych. Do tej grupy należą rodzaje takie jak Pseudomonas, Bacillus, Micrococcus, Flavobacterium, Agrobacterium, Xanthomonas, Salmonella, Escherichia, Rhizobium, enterokoki czy Vibrio. W literaturze anglojęzycznej ta grupa bakterii jest określana jako HPC (heterotrophic plate count), obejmując bakterie hodowlane, psychrofilne i mezofilne.

Mikroorganizmy hodowlane

  
Dopuszczalna zawartość mikroorganizmów w wodzie pitnej w Polsce została po raz pierwszy określona w rozporządzeniu z 27 sierpnia 1933 roku. Po wielu modyfikacjach, obecnie obowiązuje Rozporządzenie Ministra Zdrowia z 7 grudnia 2017 roku dotyczące jakości wody przeznaczonej do spożycia przez ludzi. Dodatkowo oddzielne rozporządzenie z 31 marca 2011 roku reguluje dopuszczalne zawartości mikroorganizmów w wodach naturalnych, mineralnych i pitnych.

Jakość wody w kąpieliskach i miejscach okazjonalnie wykorzystywanych do kąpieli określa Rozporządzenie Ministra Zdrowia z 17 stycznia 2019 roku, a woda basenowa jest regulowana Rozporządzeniem z 9 listopada 201 5r. w sprawie wymagań, jakim powinna odpowiadać woda na pływalniach. Bakterie wskaźnikowe, drożdże i pleśnie zaklasyfikowane do tej grupy namnażają się najlepiej w temperaturze od 20 do 36˚C. Do ich hodowli stosuje się pożywkę agarową z ekstraktem drożdżowym, a kolonie zaczynają powstawać po 2-3 dniach inkubacji

Bakterie psychrofilne

Bakterie psychrofilne to organizmy mikrobiologiczne, które preferują niskie temperatury do wzrostu i rozmnażania. Mają one optimum wzrostu w okolicach 20°C, co oznacza, że rozwijają się najlepiej w temperaturach zbliżonych do tej wartości. Do hodowli tych bakterii stosuje się agar masopeptonowy, który zawiera składniki odżywcze niezbędne do ich wzrostu, takie jak pepton (białka pochodzenia zwierzęcego) i wyciągi mięsne. Kolonie bakterii psychrofilnych rozwijają się na agarze masopeptonowym przez okres inkubacji trwający zazwyczaj 3 dni. Jest to czas potrzebny, aby bakterie wytworzyły dostateczną liczbę komórek i tworzyły widoczne kolonie.

Bakterie mezofilne

Bakterie mezofilne to organizmy mikrobiologiczne, które preferują średnie temperatury do wzrostu i rozmnażania. Mają one optimum wzrostu w okolicach 37°C, co odpowiada temperaturze ciała ludzkiego. Podobnie jak w przypadku bakterii psychrofilnych, okres inkubacji bakterii mezofilnych jest podobny, a kolonie zaczynają się tworzyć po około 2 dniach inkubacji. Obecnie przepisy nie wymagają już ich oznaczania w żadnym rodzaju wody. To może oznaczać, że zmieniono priorytety lub uznano, że obecność tych bakterii w wodzie nie stanowi już takiego zagrożenia dla zdrowia publicznego, jak wcześniej sądzono. Jednak nadal istnieją inne parametry jakości wód, które są monitorowane, aby zapewnić bezpieczeństwo użytkowników.

Wskaźniki zanieczyszczenia fekaliami

Wskaźniki zanieczyszczenia fekaliami obejmują przede wszystkim bakterie, których występowanie w wodzie może sugerować obecność patogenów jelitowych, takich jak salmonella, shigella lub patogenne szczepy Escherichia coli. Szczególnie istotne jest, aby wybrane bakterie służące jako wskaźniki zanieczyszczenia kałem były pozbawione cech patogennych.

Salmonella wywołuje ostrą biegunkę

Aby bakterie były adekwatnymi wskaźnikami zanieczyszczenia fekaliami, powinny występować w dużych ilościach w odchodach stałocieplnych zwierząt, głównie ssaków. Nie powinny się namnażać w wodzie, ale utrzymywać się w niej tak długo, jak patogeny chorobotwórcze. Powinny również charakteryzować się odpornością na środki dezynfekujące i środowisko. Istotne jest również, aby ich wykrycie było łatwe.

Należy zaznaczyć, że żadna z bakterii używanych obecnie jako wskaźniki zanieczyszczenia fekaliami nie spełnia w pełni wszystkich kryteriów. Najczęściej stosowane są Escherichia coli, termotolerancyjne bakterie grupy coli, enterokoki jelitowe oraz Clostridium perfringens. Te dwa ostatnie są szczególnie wykorzystywane do oceny skuteczności procesów uzdatniania wody pitnej.

Bakterie E-coli

 
Bakterie z grupy coli to Gram-ujemne pałeczki, które nie tworzą form przetrwalnikowych. Charakteryzują się negatywnym wynikiem testu na obecność oksydazy cytochromowej oraz tworzą kolonie w warunkach tlenowych podczas 24-godzinnej hodowli w temperaturze 36±2°C na selektywnym podłożu różnicującym z laktozą, przy jednoczesnej produkcji kwasów lub aldehydów.
Definicja bakterii z grupy coli według normy EN ISO 9308-1 jest bardzo dokładna. Są to Gram-ujemne bakterie w formie pręcików, które do efektywnego rozwoju wymagają warunków tlenowych, co oznacza, że nie mogą przetrwać bez tlenu. Tworzą one kolonie w temperaturze 37°C na selektywnym podłożu hodowlanym zawierającym laktozę, z której wytwarzają kwasy lub aldehydy.

Bakterie z grupy coli nie tworzą form przetrwalnikowych, są Gram-ujemne (co oznacza, że w ostatnim etapie barwienia metodą Grama będą różowe) i wykazują ujemny wynik testu na obecność oksydazy cytochromowej. Początkowo do tej grupy zaliczano bakterie z rodzajów Escherichia, Citrobacter, Klebsiella i Enterobacter, ale została ona rozszerzona o Serratia, Hafnia i Rahnella. Aktualna definicja, pochodząca z 1994 roku, może ulec dalszym zmianom z powodu rozwoju metod analitycznych opartych na aktywności enzymu β-D-galaktozydazy, pierwszego enzymu biorącego udział w rozkładzie laktozy.

Bakterie E-coli

Bakterie z grupy coli, z których najczęściej spotykana jest Escherichia coli, występują w jelitach ludzi i zwierząt, co czyni je wskaźnikami zanieczyszczenia fekaliami. Aktywność enzymu β-D-galaktozydazy umożliwia uwzględnienie większej liczby bakterii w tej grupie niż tylko te produkujące końcowe produkty rozkładu laktozy. Zgodnie z obowiązującymi przepisami, konieczne jest monitorowanie obecności bakterii z grupy coli w wodzie pitnej, butelkowej, kąpieliskach i na pływalniach, aby zapewnić bezpieczeństwo sanitarne.

Termotolerancyjne bakterie z grupy coli

Bakterie termotolerancyjne z grupy coli mają definicję podobną do standardowych coli, z wyjątkiem temperatury, w której rozwijają się kolonie – w ich przypadku wynosi ona 44˚C. Do tej grupy należą bakterie z rodzajów Escherichia, Citrobacter, Klebsiella i Enterobacter. Choć pierwotnie uważano, że ich źródłem jest przewód pokarmowy, odkryto, że mogą występować także w wodzie przemysłowej, rozkładającym się materiale roślinnym i glebie. Są używane do oceny jakości wody pitnej oraz skuteczności dezynfekcji.

Escherichia coli

Zgodnie z normą EN ISO 9308-1, Escherichia coli to bakterie z grupy coli, które mają zdolność wytwarzania indolu z tryptofanu.  Zgodnie z polskim prawem, obecność E. coli musi być monitorowana w wodzie pitnej, butelkowanej, kąpieliskowej oraz basenowej.

Bakterie jako wskaźniki analizy wody: możliwe problemy

Jak już wspomniano, żadna z baterii stosowanych jako wskaźnik zanieczyszczenia fekaliami nie jest idealna. Problem z bakteriami z grupy coli polega na tym, że obejmują one zarówno gatunki charakterystyczne dla kału, jak i te występujące w środowisku naturalnym. Podobnie jest z bakteriami termotolerancyjnymi, które mogą pochodzić z wody przemysłowej, rozkładających się materiałów roślinnych lub gleby.

Przydatność bakterii wskaźnikowych jest więc stale kwestionowana, zwłaszcza w ostatnich latach. Przykładem mogą być badania, które sugerują, że gdyby enterokoki zostały użyte jako wskaźniki zanieczyszczenia fekaliami w wodzie morskiej, mogłoby to prowadzić do częstszego zamykania wielu obszarów rekreacyjnych. Ma to związek z faktem, że poziomy enterokoków częściej przekraczały limity zdrowotne niż bakterie z grupy coli lub termotolerancyjne.